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丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK)試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

丙酮酸磷酸雙激酶PPDK試劑盒 光合系列

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

丙酮酸磷酸雙激酶（pyruvate phosphate dikinase, PPDK, EC 2.7.9.1）是C4 途徑和景天科酸代謝途徑的限速酶，催化 ATP、丙酮酸和 Pi 經(jīng)三步反應生成磷酸烯醇式丙酮酸。該酶主要存在于 C4 植物的葉綠體基質(zhì)中，對光合功能具有重要調(diào)節(jié)作用。

測定原理：

PPDK 的逆向反應催化磷酸烯醇式丙酮酸、AMP 和PPi 生成丙酮酸、ATP 和Pi，乳酸脫氫酶進一步催化丙酮酸和NADH 生成乳酸和NAD⁺，在 340nm 測定NADH 減少速率，計算 PPDK 活性。

組成：

試劑三 ：液體 60μl×1 支，4℃保存；體積較少，若沾在管壁上，臨用前可低速離心后使用。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1ml 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟和加樣表：

1、分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

工作液的配制：臨用前取試劑二一瓶加入 25ml 試劑一和 12.5μl 試劑三，充分混勻，置于 37℃水浴 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

在 1ml 石英比色皿中加入 50μl 樣本和 950μl 工作液，混勻，立即記錄 340nm 處初始吸光值A1 和37℃反應 5min 后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

PPDK 活性計算：

按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PPDK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PPDK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=643×ΔA÷W

V 反總：反應體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.05ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。

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