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苯胺-4-羥化酶（AH）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/24 樣

苯胺-4-羥化酶AH試劑盒P450

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

細(xì)胞色素P450 酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。AH 在P450 酶系中相當(dāng)于CYP2E1 亞型，CYP2E1 不僅參與了藥物的代謝，而且還能催化多種前致癌物和前毒物的活化過程。

測(cè)定原理：

AH 催化苯胺羥化后產(chǎn)生的 4-氨基酚，進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榉?吲哚復(fù)合物，在 630nm 處有特征吸收峰；通過測(cè)定 630nm 吸光度增加速率，來計(jì)算AH 活性。

組成：

試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 50ml 蒸餾水，充分溶解。試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 26ml 蒸餾水，充分溶解。試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 13ml 蒸餾水，充分溶解。

試劑六：粉劑×1 瓶（腐蝕性試劑），4℃避光保存。臨用前加入 26ml 蒸餾水，充分溶解。試劑七：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 26ml 蒸餾水充分溶解。

標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1 瓶，10μmol/L，4℃避光保存。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、普通離心機(jī)、超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、1ml 玻璃比色皿、雙蒸水和冰。

粗酶液提取：

1、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約 0.5g 組織，加入 1ml 試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃，離心 30min，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。

2、粗制微粒體： 100 000g 4℃，離心 60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1ml 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g 離心 30min，棄上清液。

4、最終微粒體：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5ml，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測(cè)。

測(cè)定操作：

分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 630 nm，蒸餾水調(diào)零。

試劑三置于 37℃水浴中預(yù)熱 30min。

試劑五置于冰浴預(yù)冷 30min。

標(biāo)準(zhǔn)管：取 1.5ml EP 管，加入 500μl 標(biāo)準(zhǔn)液，500μl 試劑六，500μl 試劑七，混勻后室溫靜置 30min，于 630 nm 測(cè)定光吸收，記為A 標(biāo)準(zhǔn)管。

對(duì)照管：取 1 支 1.5ml EP 管，加入 250μl 粗酶液，500μl 試劑三，250μl 蒸餾水，混勻后 37℃水浴中保溫 30min；再加入 500μl 試劑五，混勻后冰浴 5min，11000rpm，4℃，離心 10min；取 500μl 上清液，加入 1 支新的 1.5ml EP 管；再加入 500μl 試劑六，500μl 試劑七，混勻后室溫靜置 30min，于 630 nm 測(cè)定光吸收，記為A 對(duì)照管。

測(cè)定管：取 1 支 1.5ml EP 管，加入 250μl 粗酶液，500μl 試劑三，250μl 試劑四，混勻后 37℃水浴中保溫 30min；再加入 500μl 試劑五，混勻后冰浴 5min，11000rpm，4℃，離心 10min；取 500μl 上清液，加入 1 支新的 1.5ml EP 管；再加入 500μl 試劑六，500μl 試劑七，混勻后室溫靜置 30min，于 630 nm 測(cè)定光吸收，記為A 測(cè)定管。

AH 活性計(jì)算公式：

按照蛋白濃度計(jì)算:

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 4-氨基酚為 1 個(gè)酶活單位。

AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 2×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計(jì)算:

活性單位定義：37℃中每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 4-氨基酚為 1 個(gè)酶活單位。

AH 活性(nmol/min/g 鮮重)= C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(W×V 樣)÷T

= 2×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)品：10μmol/L；V 標(biāo)準(zhǔn)品：500μl=0.0005L；稀釋倍數(shù)：V 反總÷V 上清液=1500μl÷500μl=3；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度，mg/ml，需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；V 樣：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積，250μl=0.25ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。

苯胺-4-羥化酶AH試劑盒P450