產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本產(chǎn)品是基于熒光探針檢測(cè)的即用型 RT-PCR 試劑盒，可以對(duì)靶 RNA 分子進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 分析（quantitative RT-PCR、qRT-PCR）。產(chǎn)品含有經(jīng)過優(yōu)化的緩沖液組分、逆轉(zhuǎn)錄酶、熱啟動(dòng) Taq DNA 聚合酶、Taq DNA 穩(wěn)定劑dNTPs、MgCl2 和穩(wěn)定劑等所有實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 所需要的成分，用戶只需加入 RNA 模板、引物和探針即可進(jìn)行探針法實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 反應(yīng)，具有廣泛的用途。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.以 2×Mix 提供，用戶只需準(zhǔn)備模板、引物、探針和 ROX 染料（取決于 qPCR儀器）即可以進(jìn)行探針法實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 實(shí)驗(yàn)，非常方便快捷，降低了操作誤差。

2.各成分的濃度和比例都經(jīng)過精心優(yōu)化，反應(yīng)的靈敏度高，特異性強(qiáng)。靈敏度  最高時(shí)可以達(dá)到 50 拷貝/反應(yīng)（跟模板質(zhì)量，引物設(shè)計(jì)等相關(guān)）。

3.既可用于TaqMan 探針qRT-PCR，也可以是分子信標(biāo)（molecular beacon的 qRT-PCR。

4.靈敏度和專一性比染料法熒光定量 RT-PCR 更高。

5.可用于基因表達(dá)分析、SNP 分析、拷貝數(shù)分析等實(shí)驗(yàn)。也可以用于定性檢。

6.探針法qRT-PCR試劑盒只能用于科研，1 mL 足夠 100 次 20 μL 體系的探針法 qRT-PCR反應(yīng)。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50次

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

放置三周。

自備試劑

RNA 模板、引物、TaqMan 探針、超純水。

使用方法：

一、如果有 N 個(gè)樣品并且做定量分析，最好設(shè)置 N+7 個(gè)反應(yīng)，多出的 7 個(gè)中， 6 個(gè)是做標(biāo)準(zhǔn)曲線的陽性對(duì)照，一個(gè)是陰性對(duì)照（NC）。在 N+7 個(gè) PCR 管中加入下列成分。如果是做定性分析，則 6 個(gè)做標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品縮減成一個(gè)陽性對(duì)

照（PC），用戶自己需要根據(jù)下表進(jìn)行適當(dāng)修改（把 6 個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)改成 1 個(gè)陽

性對(duì)照反應(yīng)）。

成分N 個(gè)樣品

管6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

管NC 管

探針法 qRT-PCR 緩沖液各 10 μL10 μL10 μL

自備引物 1（10 μM）各 1 μL各 1 μL1 μL

自備引物 2（10 μM）各 1 μL各 1 μL1 μL

N 個(gè)自備模板 RNA各 1-2 μL不加不加

自備陽性對(duì)照模板（6 個(gè)梯度）不加各 1 μL（1 管

加 1 個(gè)梯度）不加

陰性對(duì)照模板（水）不加不加1 μL

自備探針（5 μM）各 1 μL各 1 μL1 μL

自備 50×ROX I 染料或自備

50×ROXII 染料（見注）各 0.4 μL各 0.4 μL0.4 μL

探針法 qRT-PCR 酶混合液2 μL2 μL2 μL

補(bǔ)超純水到20 μL20 μL20 μL

注，下列信息僅供參考，具體以 qPCR 儀器的使用手冊(cè)為準(zhǔn)。

1、不需要ROX 的機(jī)型：AgilentMX3000 和MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480、SmartCycler System、Thermal Cycler Dice RealTime System 等型號(hào)的熒光 PCR 儀器不需要加 ROX 染料，但加入的話也不會(huì)影響整個(gè) PCR 分析2、需要使用ROXI 的機(jī)型：ABIPrism7000、7300、7700、7900HT、Step One Step One Plus。

3、需要使用 ROXII 的機(jī)型：ABIPrism7500、7500Fast、MJ Opticon、MJ Chromo4、CorbettRotorGene3000。

二、放入熒光 PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增, 下表的擴(kuò)增參數(shù)僅供參考，一定需要根據(jù)靶分子長(zhǎng)度，引物和探針的 Tm 值、標(biāo)記染料的種類等進(jìn)行調(diào)節(jié)。一般選擇三步法PCR：蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR：

三、數(shù)據(jù)處理

1. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性。一般情況下，陰性對(duì)照 Ct 大于或等于 40（閾值需要以陰性

對(duì)照的Ct 值確定，此處為便于敘述以40 為例，具體情況很可能閾值不一樣）

陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于

40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。

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