Transwell實驗技術(shù)

微孔濾膜培養(yǎng)小室及雙室聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)（Transwell 實驗）：應(yīng)用微孔濾膜培養(yǎng)小室，進行膠質(zhì)瘤細胞與內(nèi)皮細胞的聯(lián)合培養(yǎng)，可以更接近體內(nèi)環(huán)境，模擬瘤細胞對血管內(nèi)皮細胞的作用，濾膜上8μm的微孔可允許內(nèi)皮細胞穿過到達膜的下面，這些穿越遷移的內(nèi)皮細胞可粘附于膜的下面，通過計數(shù)濾膜下面的細胞可基本反映細胞的遷移情況。Transwell的基本原理是將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱為上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱為下室，上室內(nèi)添加上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)添加下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以膜相隔。將細胞種在上室內(nèi)，由于膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影。選擇不同材料的膜和孔徑，可以進行共培養(yǎng)、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。

（一）實驗材料及試劑

24孔培養(yǎng)板、Transwell小室、倒置顯微鏡、酒精燈、移液槍、CO₂培養(yǎng)箱、細胞計數(shù)板等；血清、低血清DMEM培養(yǎng)液、多聚甲醛、結(jié)晶紫、PBS等。

（二）實驗內(nèi)容

1、分別取實驗分組的細胞種板前1天，血清饑餓12小時，常規(guī)消化、離心收集細胞，用低血清DMEM培養(yǎng)液（含0.2% FBS）混懸成密度為5×10⁵/ml的單細胞懸液。

2、將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中，上室內(nèi)加入100 μl細胞懸液（約5×10⁴細胞），下室內(nèi)加入500 μl含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液。

3、置于5% CO₂，37℃孵箱培養(yǎng)24小時后，PBS洗2次，用棉球小心擦去上室內(nèi)細胞，4%多聚甲醛固定20~30 min，PBS洗2次，0.1 %結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗2次，去掉多余染料，顯微鏡下觀察拍照。

（三）注意事項

Transwell小室可重復(fù)利用多次，但在棉簽擦拭的時候力度避免過大，以免損傷小室膜；重復(fù)使用之前可觀察小室膜是否出現(xiàn)裂痕，若出現(xiàn)較多裂痕可停止使用。