Western Blot 常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

一、背景過(guò)高

原因：

封閉不充分；一抗過(guò)濃；孵育溫度過(guò)高；一抗二抗封閉劑間有交叉反應(yīng)；洗膜不充分；膜過(guò)于干燥

方案：

延長(zhǎng)封閉時(shí)間或更換封劑；稀釋一抗；4℃孵育；加入Tween-20，以減少交叉反應(yīng)；設(shè)二抗對(duì)照，稀釋二抗；增加洗膜次數(shù)；避免干膜

二、無(wú)條帶或太弱

原因：

一抗二抗選擇錯(cuò)誤；一抗二抗?jié)舛冗^(guò)低；一抗失效；蛋白含量過(guò)低；轉(zhuǎn)膜不充分或洗膜過(guò)度；過(guò)度封閉；二抗受疊氛鈉抑制；底物與酶失效；曝光時(shí)間過(guò)短

方案：

選擇正確抗體；檢查抗體和顯色試劑盒保質(zhì)期；提高樣品蛋白含量；設(shè)內(nèi)參對(duì)照，轉(zhuǎn)膜對(duì)照；轉(zhuǎn)膜效果的檢查；減少洗膜時(shí)間

降低封閉液濃度，減少封閉時(shí)間；延長(zhǎng)曝光時(shí)間

三、雜帶過(guò)多

原因：

蛋白樣本具有多種修飾；蛋白樣本降解；蛋白存在二聚體或多聚體；一抗二抗?jié)舛冗^(guò)高；多克隆抗體

方案：

使用去修飾的試劑；使用蛋白酶抑制劑；電泳上樣前，煮沸10 min，以增強(qiáng)蛋白質(zhì)解聚變性；降低抗體濃度；選用單克隆抗體

四、其他問(wèn)題

1.背景白色條帶 → 轉(zhuǎn)膜時(shí)有氣泡或抗體分布不均

2.暗片現(xiàn)白條帶 → 一抗或二抗加入過(guò)多

3.目的條帶過(guò)低/過(guò)高 → 膠濃度不合適

4.“微笑"條帶 → 遷移過(guò)快、電泳溫度過(guò)高