干貨 | CRISPR技術(shù) 譜系追蹤新時代，助力科研突破！

譜系追蹤技術(shù)猶如一把解鎖生命奧秘的“時光機(jī)”，通過為每個細(xì)胞賦予 的“條形碼”，記錄并分析這些信息，構(gòu)建出細(xì)胞家族的“族譜”——細(xì)胞譜系樹。該技術(shù)能夠追溯生物體內(nèi)每個細(xì)胞的起源與分化歷程，揭示細(xì)胞從胚胎發(fā)育到成熟個體的動態(tài)演變過程。這項(xiàng)技術(shù)不僅清晰展現(xiàn)了細(xì)胞間的親緣關(guān)系，還記錄了它們在時間和空間上的動態(tài)變化，為深入理解發(fā)育、疾病和再生等生命過程提供了關(guān)鍵線索，其應(yīng)用場景包括發(fā)育生物學(xué)、腫瘤研究、免疫學(xué)和再生醫(yī)學(xué)等。隨著單細(xì)胞測序等高新技術(shù)的不斷發(fā)展，目前常見的譜系追蹤技術(shù)主要有如下幾種：

表1.常見譜系追蹤技術(shù)原理及特點(diǎn)

近日，中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院彭廣敦研究團(tuán)隊的最新突破，為譜系追蹤技術(shù)注入了新的活力。該團(tuán)隊成功開發(fā)出新型單細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)——DuTracer。該技術(shù)創(chuàng)新性地結(jié)合了CRISPR-Cas9和Cas12a兩種基因編輯工具，顯著提升了細(xì)胞譜系追蹤的精度和深度[3]。傳統(tǒng)的細(xì)胞譜系追蹤方法，因技術(shù)限制致使信息記錄不全，而基于CRISPR的基因編輯技術(shù)提高了分辨率，卻存在靶點(diǎn)間大片段刪除難題，如同在記錄家族歷史時丟失關(guān)鍵代際信息。DuTracer的創(chuàng)新之處在于同時利用Cas9和Cas12a兩種核酸酶，并通過控制它們的激活時間，避免多靶點(diǎn)同時編輯引發(fā)的示蹤信息丟失。實(shí)驗(yàn)顯示，該技術(shù)在小鼠胚胎干細(xì)胞和類器官模型中大幅降低了有害刪除事件，且記錄的細(xì)胞分裂層級更深，能夠更精準(zhǔn)地還原細(xì)胞分化路徑。

圖1.DuTracer設(shè)計原理

接下來，小編將為大家重點(diǎn)推薦幾款明星產(chǎn)品，助您輕松開啟科研探索之旅！

Cas9 Nuclease來源于野生型釀膿鏈球菌S. pyogenes，是依賴RNA介導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶，可以特異地切割雙鏈DNA（在DNA PAM存在的情況下，也可以切割單鏈DNA或單鏈RNA）。Cas9切割位點(diǎn)位于目標(biāo)序列內(nèi)，離PAM（NGG）區(qū)3個堿基。本產(chǎn)品經(jīng)過密碼子優(yōu)化及核定位信號（NLS）設(shè)計，由大腸桿菌重組表達(dá)而來，編輯效率高，可用于細(xì)胞（造血干細(xì)胞、T細(xì)胞等）的基因修飾，也可用于分子診斷，檢測病原體等。

A：體外切割測試：3批次體外切割活性均達(dá)98%以上；

B：體內(nèi)基因敲除，敲除效率與進(jìn)口品牌一致。

圖2.Cas9 Nuclease體外切割活性及基因敲除效率結(jié)果

ArCas12a核酸內(nèi)切酶，源自Agathobacter rectalis細(xì)菌的CRISPR系統(tǒng)，別名Cpf1，是一個包含1263個氨基酸的單體蛋白。Cas12a缺乏HNH結(jié)構(gòu)域，可單獨(dú)利用其RuvC結(jié)構(gòu)域在CRISPR RNA（crRNA）引導(dǎo)下識別位于靶標(biāo)核酸5’端富含胸腺嘧啶（T）的PAM區(qū)而啟動對靶標(biāo)DNA的切割，已成功用于許多哺乳動物和植物的基因組編輯。此外Cas12a還具有反式切割活性，可不加選擇地切割反應(yīng)體系中的非靶標(biāo)單鏈DNA。與LbCas12a/AsCas12a相比，ArCas12a具有更高的溫度適應(yīng)性（25-55℃），可適用于基因組編輯及核酸檢測等。

圖3.ArCas12a順式切割活性檢測 M：Marker；C：模板雙鏈DNA

注：在crRNA的引導(dǎo)下可高效的切割雙鏈DNA（600 bp）產(chǎn)生兩段切割產(chǎn)物（200 bp+400 bp）

圖4.ArCas12a反式切割活性檢測

注：以雙鏈DNA模板為靶標(biāo)，加入ArCas12a、crRNA（存在與模板DNA序列互補(bǔ)的spacer區(qū)）及單鏈DNA報告探針（含有熒光報告基團(tuán)）進(jìn)行體外切割，當(dāng)ArCas12a與crRNA及靶標(biāo)DNA形成復(fù)合體后會激活反式切割活性，切割單鏈DNA報告探針，從而發(fā)出熒光。結(jié)果顯示，翌圣ArCas12a與crRNA及模板DNA形成復(fù)合體后具有反式切割活性，可剪切單鏈DNA。

AapCas12b核酸酶（又名C2c1）是由tracrRNA:crRNA（或sgRNA）介導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶，來源于嗜酸耐熱菌Alicyclobacillus acidophilus，在靶標(biāo)雙鏈DNA存在PAM（TTN）序列的情況下，特異地剪切靶標(biāo)雙鏈DNA，使DNA雙鏈斷裂并生成粘性末端。AapCas12b可不依賴PAM序列特異地剪切單鏈DNA靶標(biāo)。雙鏈或單鏈DNA靶標(biāo)均能激活A(yù)apCas12b的反式剪切活性（即旁路剪切活性/附屬剪切活性），即當(dāng)AapCas12b酶與sgRNA、靶標(biāo)DNA結(jié)合形成三元復(fù)合物后，便會被激活針對非特異序列ssDNA的反式剪切活性，將體系中的任意序列ssDNA切碎。AapCas12b最佳剪切反應(yīng)溫度為60℃，比AacCas12b更耐高溫，適用于與LAMP聯(lián)用，開發(fā)恒溫擴(kuò)增/CRISPR-Cas檢測體系。

圖5.AapCas12b Nuclease (10 μM)順式切割活性驗(yàn)證

注：在20 μL的反應(yīng)體系，含有帶PMA序列的雙鏈Target DNA、sgRNA、Cas12b和1×reaction buffer，在60°C下反應(yīng)30 min，85°C下滅活5 min，在瓊脂糖凝膠電泳測定結(jié)果顯示，三批次AapCas12b Nuclease (10 μM) (Cat#14808ES)均能有效切割雙鏈Target DNA,切割效果與進(jìn)口品牌T*相當(dāng)。

圖6.AapCas12b Nuclease (10 μM)反式切割活性驗(yàn)證

注：在20 μL的反應(yīng)體系，含有帶PMA序列的雙鏈Target DNA、sgRNA、Cas12b、Report ssDNA熒光探針和1×reaction buffer，在60℃反應(yīng)1h，每30 sec采集一次熒光信號，結(jié)果顯示在Target DNA、sgRNA、Cas12b共同存在的情況下，Report ssDNA熒光探針能被切割，從而釋放熒光信號。

該試劑盒的應(yīng)用極為簡便，用戶只需設(shè)計一條特定的上游引物，并結(jié)合試劑盒提供的其他試劑，即可在短短4小時內(nèi)合成出20-100 μg高品質(zhì)的sgRNA。所產(chǎn)生的sgRNA具備高產(chǎn)量、高純度和高活性等優(yōu)勢，在基因編輯過程中能顯著提升編輯效率，并大幅降低脫靶現(xiàn)象的發(fā)生幾率，確?；蚓庉嫻ぷ饕愿咝屎透邷?zhǔn)確性進(jìn)行。

圖7.不同時間的sgRNA的合成量

圖8.不同序列的sgRNA的合成產(chǎn)量

圖9.合成的sgRNA的純度（安捷倫2100測定）

圖10.sgRNA的剪切效率效果圖

當(dāng)前，CRISPR基因編輯技術(shù)正處于快速發(fā)展的時期，整個領(lǐng)域仍在不斷成熟和完善中。隨著科學(xué)研究和技術(shù)應(yīng)用的持續(xù)推進(jìn)，我們有理由相信未來將涌現(xiàn)出更多創(chuàng)新性的基因編輯工具，這些新工具將進(jìn)一步拓寬該技術(shù)的應(yīng)用場景與潛力。

如果您對基因編輯有任何需求或興趣，歡迎隨時聯(lián)系我們。無論是在基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)、合成生物學(xué)等領(lǐng)域，我們都致力于為您提供 的技術(shù)支持和服務(wù)，共同探索基因編輯帶來的無限可能。

參考文獻(xiàn)：

[1] Kretzschmar K, Watt F M. Lineage tracing[J]. Cell, 2012, 148(1): 33-45.

[2] Hsu Y C. Theory and practice of lineage tracing[J]. Stem Cells, 2015, 33(11): 3197-3204.

[3] Chen C, Liao Y, Zhu M, et al. Dual-nuclease single-cell lineage tracing by Cas9 and Cas12a[J]. Cell Reports, 2025, 44(1).