ATCC菌株復(fù)蘇算不算傳代？種子批系統(tǒng)+5代傳代法則破解實(shí)驗(yàn)室管理難題

多年來(lái)，ATCC（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心）提供的微生物標(biāo)準(zhǔn)品已被CLSI（美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所）和USP（美國(guó)藥典）等國(guó)際權(quán)-威標(biāo)準(zhǔn)廣泛納入制藥及醫(yī)療質(zhì)量控制體系，廣泛應(yīng)用于產(chǎn)品質(zhì)控、對(duì)照實(shí)驗(yàn)及菌種鑒定。然而，盡管使用規(guī)范已高度成熟，實(shí)驗(yàn)室在傳代次數(shù)管理、非參考菌株傳代閾值界定等實(shí)操環(huán)節(jié)仍存在顯著挑戰(zhàn)。這一問(wèn)題在制藥微生物領(lǐng)域?qū)I(yè)論壇（如PMFList）中持續(xù)引發(fā)討論，凸顯了制定統(tǒng)一操作框架的迫切性。

一、參考菌株命名差異與來(lái)源要求

參考菌株的命名差異加劇了實(shí)驗(yàn)室對(duì)微生物標(biāo)準(zhǔn)品管理的困惑。在CLSI和USP的各類文件中，這類培養(yǎng)物被分別稱為“對(duì)照菌株"“標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物"“參考菌株"“測(cè)試菌株"或“質(zhì)量控制菌株"，其中“參考菌株"或“參考培養(yǎng)物"的稱呼較為普遍。

盡管這些術(shù)語(yǔ)常被混用，但兩個(gè)組織均強(qiáng)調(diào)，參考菌株必須來(lái)源于權(quán)-威機(jī)構(gòu)，ATCC（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心）是主要的推薦來(lái)源，這為實(shí)驗(yàn)室選擇參考菌株提供了明確方向。

二、ATCC參考菌株的傳代培養(yǎng)體系

ATCC的參考菌株通過(guò)傳代培養(yǎng)制成“儲(chǔ)備培養(yǎng)物"，再通過(guò)每周或每月的定期傳代培養(yǎng)制成日常使用的“工作培養(yǎng)物"，工作培養(yǎng)物通常以斜面形式保存。然而，這種傳代培養(yǎng)方式引發(fā)了人們對(duì)其是否源自原始參考菌株的疑問(wèn)。

（一）傳代計(jì)數(shù)規(guī)則的演變

核心爭(zhēng)議在于如何界定“一次傳代"的計(jì)數(shù)規(guī)則。

早期USP36-NF31<51>抗菌測(cè)試的原始定義為：“一次傳代指將生物體從已建立的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基的過(guò)程，所有轉(zhuǎn)移操作均計(jì)入傳代次數(shù)"。但未明確"已建立的培養(yǎng)物"的具體內(nèi)涵。

現(xiàn)行USP<1117>《微生物最佳實(shí)驗(yàn)室規(guī)范》對(duì)此進(jìn)行了重要修訂。更新后的定義為：“傳代指微生物從活體培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基并實(shí)現(xiàn)增殖的過(guò)程，任何形式的傳代培養(yǎng)均視為一次轉(zhuǎn)種/傳代。"這一修訂有效解決了原定義的模糊性，根據(jù)新定義，ATCC冷凍或凍干菌株的解凍或水化操作不計(jì)入傳代，只有將其接種至新鮮培養(yǎng)基并完成生長(zhǎng)后才計(jì)為首-次傳代。

因此，將ATCC冷凍或凍干小瓶中的參考菌株復(fù)蘇制備成儲(chǔ)備培養(yǎng)物屬于首-次傳代，而將儲(chǔ)備培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種為工作培養(yǎng)物則構(gòu)成第二次傳代，后續(xù)每次轉(zhuǎn)種均累計(jì)增加傳代次數(shù)。通過(guò)統(tǒng)一術(shù)語(yǔ)和明確定義，為抗菌效果測(cè)試提供了清晰可追溯的傳代計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。  

在微生物實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐中，除ATCC官-方提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株外，商業(yè)機(jī)構(gòu)常通過(guò)“ATCC衍生"方式獲得培養(yǎng)物——即從ATCC參考菌株出發(fā)，經(jīng)過(guò)一次或多次傳代培養(yǎng)獲得的菌株。

（二）“ATCC衍生"培養(yǎng)物的管理

在微生物實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐中，商業(yè)機(jī)構(gòu)常通過(guò)"ATCC衍生"方式獲得培養(yǎng)物，即從ATCC參考菌株經(jīng)一次或多次傳代培養(yǎng)所得。CLSI認(rèn)可符合資質(zhì)的商業(yè)菌株供應(yīng)商，但要求實(shí)驗(yàn)室必須關(guān)注菌株傳代歷程，從原始ATCC參考菌株到最終工作培養(yǎng)物，通常會(huì)經(jīng)歷1-2次傳代過(guò)程。

三、參考菌株管理的推薦系統(tǒng)與標(biāo)準(zhǔn)

（一）種子批系統(tǒng)的應(yīng)用

USP推薦采用種子批系統(tǒng)管理參考菌株，該系統(tǒng)與ATCC使用的系統(tǒng)一致。操作流程為：先將ATCC參考菌株一次性制備多個(gè)重復(fù)傳代培養(yǎng)物，這些源自同一代原種的重復(fù)培養(yǎng)物作為實(shí)驗(yàn)室的初代種子庫(kù)存儲(chǔ)；再將初代種子培養(yǎng)物傳代至第二代，用于制備工作菌株的多批次培養(yǎng)物，以此規(guī)范實(shí)驗(yàn)室參考菌株的保存流程。（圖1）

（二）傳代次數(shù)控制標(biāo)準(zhǔn)

不同標(biāo)準(zhǔn)對(duì)傳代次數(shù)的要求存在顯著差異。CLSI早期標(biāo)準(zhǔn)對(duì)傳代頻次要求模糊，后續(xù)修訂版提出三級(jí)傳代限制，但推算后原始菌株累計(jì)傳代可能達(dá)七次。而USP標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)<1117>章節(jié)明確規(guī)定，實(shí)驗(yàn)室工作培養(yǎng)物與ATCC參考菌株的傳代差值不得超過(guò)五次，<51>條款強(qiáng)調(diào)“檢測(cè)用活體微生物不得超出原始ATCC菌株五代傳代" ，這一量化標(biāo)準(zhǔn)被制藥行業(yè)廣泛采用，ATCC官-方也確認(rèn)五代傳代限制是維持菌株遺傳穩(wěn)定性的最佳實(shí)踐。

（三）儲(chǔ)存溫度與維護(hù)要求

菌株的儲(chǔ)存溫度對(duì)其生物學(xué)特性及存活率具有顯著影響，各標(biāo)準(zhǔn)機(jī)構(gòu)對(duì)此給出了詳細(xì)指引。

1、CLSI標(biāo)準(zhǔn)

（1）原代培養(yǎng)物：

短期保存：-50℃至-70℃保存1年。

長(zhǎng)期保存：-70℃以下。

延長(zhǎng)儲(chǔ)存：-20℃或更低溫度（優(yōu)先推薦-70℃以下）

（2）工作培養(yǎng)物（斜面）：

短期保存：2-8℃環(huán)境，保存周期≤4周。

2、USP36-NF31<51>條款

（1）培養(yǎng)物：必須儲(chǔ)存于液氮或-50℃以下的機(jī)械冷凍設(shè)備。

3、ATCC標(biāo)準(zhǔn)

（1）冷凍菌株：

長(zhǎng)期保存：液氮?dú)庀喹h(huán)境或-80℃機(jī)械冷凍箱（避免直接浸入液氮）。

甘油保護(hù)劑：含50%甘油的菌株可短期保存于-20℃（≤1個(gè)月），需避免溫度波動(dòng)（如反復(fù)凍融）。

（2）凍干菌株：2-8℃保存。

（3）凍干菌株（斜面）：2-8℃保存≤1周。

4、特殊注意事項(xiàng)

質(zhì)控菌株（如攜帶耐藥基因質(zhì)粒）：需嚴(yán)格遵循CLSI最新標(biāo)準(zhǔn)。