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ClearColi BL21(DE3) 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞
產(chǎn)品信息：
組成 BC215-01
ClearColi BL21(DE3) Competent Cells 10×100µl
pUC19（0.1ng/µl） 5µl
儲(chǔ)存條件：-70℃保存，避免反復(fù)凍融。
產(chǎn)品介紹：
脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是幾乎所有革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的一種成分。LPS 被哺乳動(dòng)物免疫細(xì)胞上的 TLR4/MD-2 識(shí)別，
從而激活 NF-kappB 信號(hào)通路，導(dǎo)致生物體炎癥反應(yīng)的發(fā)生。大腸桿菌基因工程產(chǎn)品中的殘留的 LPS 會(huì)極大地影響下游實(shí)驗(yàn)。
ClearColi 系列大腸桿菌的細(xì)菌外膜上為修飾后的類(lèi)脂 IVA((Lipid IVA )，與野生型的 LPS 相比，缺乏寡糖鏈和兩條二級(jí)酰基鏈，類(lèi)
脂 IVA 不能誘導(dǎo)活化的 hTLR4/MD-2 復(fù)合物的形成，避免了 LPS-TLR4/NF-kB 信號(hào)通路的內(nèi)毒素反應(yīng)。此外，不含寡糖的類(lèi)脂 IVA
更易從重組蛋白中去除。
ClearColi BL21（DE3）細(xì)胞的生長(zhǎng)速度約為正常 BL21（DE3）細(xì)胞的 50%。轉(zhuǎn)化后的菌落在最初 24 小時(shí)內(nèi)顯得非常小。建議
轉(zhuǎn)化后的平板先培養(yǎng)皿培養(yǎng) 36-48 小時(shí)實(shí)驗(yàn)再挑菌落進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)前，需要更長(zhǎng)的生長(zhǎng)時(shí)間才能達(dá)到所需的細(xì)胞密度。
pUC19 質(zhì)粒檢測(cè)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率大于 10 5 cfu/μg。
基因型：F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm lon λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) msbA148 ?gutQ ?kdsD ?lpxL ?lpxM
?pagP ?lpxP ?eptA
產(chǎn)品特點(diǎn)：
用于表達(dá)低內(nèi)毒素的重組蛋白。該菌株含有 T7 RNA 聚合酶和大腸桿菌 RNA 聚合酶，適用于含有 T7 啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體（如
pET 等）和非 T7 啟動(dòng)子的表達(dá)載體（如 pGEX，pMal，pTrc 等載體）在原核系統(tǒng)中的高效表達(dá)。
菌株抗性：對(duì)氨芐，，，，和四環(huán)素敏感。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟：
1. 將感受態(tài)細(xì)胞置于冰水浴中化凍。待細(xì)胞剛化凍后，加入目的質(zhì)粒到細(xì)胞中，用手指管底，輕輕混勻；
2. 冰水浴中放置 30 分鐘，不要晃動(dòng)；
3. 42℃熱擊 60 秒鐘，不要晃動(dòng)；
4. 冰水浴中放置 2 分鐘，不要晃動(dòng)；
5. 加入 500μl 無(wú)菌的 LB 培養(yǎng)基；
6. 置于 37℃搖床中，150-200rpm 震蕩復(fù)蘇培養(yǎng) 60 分鐘；
7. 取 100-200 μl 左右的菌液，涂布于含相應(yīng)抗生素的 LB 平板上，倒置放于 37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 36-48 小時(shí)。
蛋白質(zhì)誘導(dǎo)方案:
1. 從平板上挑取一個(gè)生長(zhǎng)良好的單菌落接種到 10 ml 含有合適抗生素的液體 LB 培養(yǎng)液中。
2. 37°C，200-250 rpm 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
3. 無(wú)菌條件下，接種 8 ml 過(guò)夜培養(yǎng)液到 200 ml 含有適當(dāng)抗生素的 LB 培養(yǎng)液中。或者通過(guò)測(cè)量 OD600 的方法來(lái)決定接種量，最
終 OD600 在 0.1 左右為宜。
4. 37°C，200-250rpm 振蕩培養(yǎng)，直到 OD600 達(dá)到 0.6-0.8（約 4-5 小時(shí)）。
5. 添加 IPTG 至最終濃度為 0.4-1 mM 進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。（通過(guò)溶解制備 1 M IPTG 溶液將 2.38 g IPTG 放入水中，并將最終
體積調(diào)節(jié)至 10 mL。使用前過(guò)濾滅菌）。為了確定 IPTG 誘導(dǎo)的濃度，限度地表達(dá)目標(biāo)蛋白，可以用 IPTG 梯度測(cè)試使
用濃度。
6. 37℃下振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng) 3-4 小時(shí)。為了確定目標(biāo)蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的時(shí)間，建議進(jìn)行時(shí)程實(shí)驗(yàn)，誘導(dǎo)時(shí)間 2-16 小時(shí)。
7. 誘導(dǎo)結(jié)束后，5,000×g 離心 10 分鐘收集細(xì)胞。
8. 用合適的方法（如考馬斯亮藍(lán)染膠法，Western-Blot 法或酶活性分析法）分析菌體裂解物的總蛋白、上清和沉淀組分，明確表
達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)狀況（可溶性或不溶性表達(dá)）。
9. 根據(jù)表達(dá)結(jié)果和目的蛋白質(zhì)的特點(diǎn)制定合適的蛋白質(zhì)純化方案。
注意事項(xiàng)：
1. ClearColi BL21(DE3)菌株生長(zhǎng)緩慢，平板在 37℃培養(yǎng)，時(shí)間在 36-48 小時(shí)之間。
2. ClearColi BL21(DE3) 細(xì)胞外膜中為修飾后的脂質(zhì) IVA，適合在高鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，常用 LB 培養(yǎng)基，不能用 SOB，2×YT 和
3. SOC 等培養(yǎng)基。
4. 感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)該在冰水浴中化凍，加入 DNA 后應(yīng)輕柔混勻，加入 DNA 的體積小于細(xì)胞體積的 1/10。


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重組蛋白：多項(xiàng)發(fā)明，原核表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定表達(dá)蛋白 1000 余種。


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