T7大腸桿菌表達感受態(tài)細胞 返回列表頁

T7大腸桿菌表達感受態(tài)細胞產(chǎn)品信息：  
組成                BC206-01                      BC206-02  
T7 Express Competent cells                     10×100μl                 20×100μl  
pUC19（0.1ng/μl）                   5μl                     5μl  
儲存條件：-70℃保存，避免反復凍融  
產(chǎn)品說明：

T7Express菌株為大腸桿菌BL21增強型菌株，為Lon和OmpT蛋白酶缺陷型，主要適用于含有T7啟動子的原核表達載體（如pET等）的蛋白表達，同樣適用于需要大腸桿菌RNA聚合酶來轉(zhuǎn)錄RNA的非T7啟動子的表達載體（如pGEX等）。該菌株區(qū)別于BL21(DE3)菌株的優(yōu)勢在于T7RNA聚合酶基因整合在細菌染色體上的lac操縱子區(qū)域，基因組中無λ前噬菌體序列，并具有抗T1噬菌體感染等特點。T7表達感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率大于108cfu/μg。

T7大腸桿菌表達感受態(tài)細胞基因型：  
fhuA2 lacZ::T7 gene1 [lon] ompT gal sulA11 R(mcr-73::miniTn10--TetS)2 [dcm] R(zgb-210::Tn10--TetS) endA1  
(mcrCmrr)114::IS10  
菌株抗性：對氨芐和四環(huán)素敏感  
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟：  
1. 將感受態(tài)細胞置于冰水浴中化凍。待細胞剛化凍后，加入質(zhì)粒 DNA 或 5-10μl 連接產(chǎn)物到細胞中，用手指管底，輕輕混勻；  
2. 冰水浴中放置 30 分鐘，不要晃動；  
3. 42℃熱擊 60 秒鐘，不要晃動；  
4. 冰水浴中放置 2 分鐘，不要晃動；  
5. 加入 500μl 無菌的 SOC 或 LB 培養(yǎng)基；  
6. 置于 37℃搖床中，150-200rpm 震蕩復蘇培養(yǎng) 60 分鐘；  
7. 取 50-100μl 菌液涂布在含有抗性的 LB 平板上。待液體吸干后，倒置平板，37℃培養(yǎng) 12-16 小時。  
（平板劃線分離法：復蘇培養(yǎng)結(jié)束后，12000rpm 離心 30 秒鐘，棄掉上清，留 100μl 左右的液體，用 200μl 吸  
頭輕輕吹打散菌塊，取 10μl 重懸的菌液分多點滴在平板上，傾斜吸頭，用吸頭頭部的側(cè)面將滴在平板上的  
液體來回劃線。這個方法可以獲得更多更大的單克隆菌落。）  
（質(zhì)?？焖俎D(zhuǎn)化步驟：將步驟 2 的時間縮短到 5 分鐘，對于氨芐抗性的質(zhì)粒，步驟 4 完成后，可直接涂  
布或劃線于含氨芐抗性的 LB 平板上。其它抗性的質(zhì)粒仍需 60 分鐘的復蘇培養(yǎng)。）  
蛋白表達步驟：  
1. 挑取單菌落，接種到含 5ml 帶抗生素的 LB 培養(yǎng)基中；  
2. 37℃，200rpm 震蕩培養(yǎng)細菌至對數(shù)生長期（OD600=0.4-0.8）；  
3. 加入 IPTG 到終濃度為 0.4mM，37℃誘導 2-4 小時或 16℃誘導過夜；  
4. 誘導完成后，離心收集菌體，用合適的方法（如考馬斯亮藍染膠法，Western-Blot法或酶活性分析法）；  
分析菌體裂解物的總蛋白、上清和沉淀組分，明確表達產(chǎn)物的表達狀況（可溶性或不溶性表達）；  
5. 大量表達時，可用10ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到1L培養(yǎng)基中，當培養(yǎng)到OD600=0.4-0.8時，加入終濃度為0.4mM的IPTG，37℃誘導 2-4 小時或 16℃誘導過夜（不同蛋白表達的條件有所不同，需在實驗中優(yōu)化）。