AGL1 農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞 返回列表頁

AGL1 農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞產(chǎn)品組成：

組成                                    BC306-01    
AGL1 Electrocompetent cells             20×50μl      
 pCAMBIA2301 (10ng/μl)                  1 支  
儲存條件：-70℃保存，避免反復(fù)凍融  
基因型：C58RecA (Rif R /Carb R ) TipTiBo542DT-DNA(StrR ) ,Succinamopine type
產(chǎn)品說明：  

AGL1菌株為農(nóng)桿菌C58,RecA型背景(Lazoetal.,1991)，核基因中含有抗性基因(Rif)和羧芐抗性基因(Carb)。此菌株還攜帶一種自身轉(zhuǎn)運功能喪失的質(zhì)粒(disarmedTiplasmid)，AGL1菌株含有琥珀堿型Ti質(zhì)粒pAGL0(pTiBo542DT-DNA)，該質(zhì)粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組所必需的元件，pAGL0(pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可輔助植物雙元表達載體的T-DNA的轉(zhuǎn)移）。pAGL0(pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒還含有Str抗性基因，賦予AGL1菌株抗性。AGL1農(nóng)桿菌適用于水稻、擬南芥、楊樹等植物的轉(zhuǎn)基因操作。AGL1電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，經(jīng)pCAMBIA2301質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率大于105cfu/μgDNA。

AGL1 農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞操作方法：   

1. 電極間距為0.1cm的電轉(zhuǎn)杯（Gene Pulser®/MicroPulser™ electroporation cuvettes）插入碎冰中，壓實冰面，冰中靜置5分鐘，使電轉(zhuǎn)杯充分降溫。（電轉(zhuǎn)杯重復(fù)使用方法：每次用完后，用大量的自來水沖洗干凈去掉菌液和DNA，用蒸餾水洗3遍，將其泡在75%乙醇中30分鐘，取出杯子，瀝干液體，放在超凈臺中，使乙醇充分揮發(fā)，蓋上蓋子放干燥地方備用）。     

2. 取-70℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入10ng-1μg質(zhì)粒DNA（洗脫或溶解質(zhì)粒的溶液中離子不能太高，可用雙蒸水稀釋。次使用前做預(yù)實驗確定所加質(zhì)粒的量），用手管底混勻，立即插入冰中，在超凈臺中用無菌吸頭將感受態(tài)-質(zhì)粒混合物快速移到電擊杯中，蓋上杯蓋，空管保留待用。   

3. 啟動電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置電擊參數(shù)：C=25μF，PC=200ohm，V=2.4KV（此參數(shù)為BioRad公司推薦，依據(jù)不同電轉(zhuǎn)儀設(shè)置針對農(nóng)桿菌合適的電擊參數(shù)）。用紙巾擦掉電轉(zhuǎn)杯外部的水分，將電轉(zhuǎn)杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中進行電擊步驟。電擊完成后，將電轉(zhuǎn)杯快速插入冰中，加入700μl無抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到原來保留的感受態(tài)空管中，28℃，150-200rpm，振蕩培養(yǎng)2-3小時。   

4. 6000rpm 離心一分鐘收菌，留取200μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊，取100μl的菌液涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天（當(dāng)平板只含有50μg/ml Kan 時，28℃培養(yǎng)48小時即可；平板中同時加入50μg/ml Kan，20μg/ml Rif 時，需28℃培養(yǎng)60小時；如果使用的平板含有50μg/mlRif則需要28℃培養(yǎng)72-90小時）。   

注意事項：   

1. 混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作，加入質(zhì)粒的體積不大于感受態(tài)體積的1/10，質(zhì)粒不純或超大質(zhì)粒會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率急劇下降。   

2. 平板上菌落過多時，菌落很小。為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量或減少涂布量，或?qū)⒕滢D(zhuǎn)移到新平板上生長。   

3. 使用的工作濃度濃度不應(yīng)高于25 μg/ml，過高的濃度會降低生長速度和轉(zhuǎn)化效率。   

4. 具有防止雜菌生長篩選農(nóng)桿菌的作用；根據(jù)所用菌株抗性加入或可防止Ti質(zhì) 粒丟失，但不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時可不考慮添加，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低 (可忽略)。   

Lazo GR, Stein PA, Ludwig RA (1991) A DNA transformation-competent Ara bidopsis genomic library in   

Agrobacterium. BioTechnology 9:963-967。