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Bottom-Up 方法在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)中的挑戰(zhàn)與機(jī)遇檢測(cè)技術(shù)服務(wù)詳情介紹

Bottom?Up dànbáizhì組學(xué)，也稱為“shotgun proteomics"，是將dànbáizhì在體外酶解成肽段，然后通過(guò)液相色譜–質(zhì)譜（LC–MS/MS）鑒定多肽，再推斷原始dànbáizhì的方法。與 top?down 方法直接分析完整蛋白不同，bottom?up 更適合高通量鑒定，但僅覆蓋蛋白片段信息。在單細(xì)胞dànbáizhì組學(xué)（SCP）背景下，bottom?up 方法需要從體積只有數(shù)皮升（pg 級(jí)）的細(xì)胞中提取足夠肽段，再進(jìn)行靈敏的 MS 檢測(cè)，這給樣本制備、分離效率、肽段覆蓋度及質(zhì)譜靈敏度提出嚴(yán)苛挑戰(zhàn)。Bottom-Up 方法在單細(xì)胞dànbáizhì組學(xué)中既面臨因樣本極微所引發(fā)的一系列技術(shù)難題，也受益于微流控、質(zhì)譜技術(shù)和數(shù)據(jù)科學(xué)的迅猛發(fā)展。未來(lái)，研究Bottom-Up 方法在單細(xì)胞dànbáizhì組學(xué)中的挑戰(zhàn)與機(jī)遇是發(fā)揮Bottom?Up dànbáizhì組學(xué)重要作用的必要條件。

一、樣本制備：納升級(jí)微操作的挑戰(zhàn)

1、微量樣本的高效裂解與提取

單細(xì)胞總dànbáizhì量通常只有幾百 pg，因此任何吸附和表面損失都可能致使檢測(cè)失敗

（1）微流控芯片（如 Chip?Tip 方法）：利用 ProteoCHIP EVO 96，將單細(xì)胞在微孔中裂解、提取，并無(wú)縫對(duì)接 Evosep LC + Orbitrap Astral MS，實(shí)現(xiàn)高通量與高敏感度。yītiān可處理 ~120 個(gè)細(xì)胞，識(shí)別率可達(dá) 5000 種蛋白，有力降低技術(shù)門檻。

（2）納升級(jí)試劑、極低體積操作：自動(dòng)化液體處理平臺(tái)可控制在 nL–µL，減少人為誤差和樣品損失。

2、多重標(biāo)簽與載體載體策略

類似單細(xì)胞 RNA 測(cè)序中的 index 技術(shù)，SCP 采用 TMT（Tandem Mass Tag）同位素標(biāo)記，將多個(gè)細(xì)胞樣品混合檢測(cè)，通過(guò) MS2 報(bào)告離子定量

（1）載體細(xì)胞（carrier cell）策略：添加較高量的肽段樣本提高 MS1 信號(hào)，提升 peptide-spectrum match 識(shí)別率。

然而過(guò)量載體可能導(dǎo)致低豐度細(xì)胞特異肽段被稀釋降低檢測(cè)，需jīngzhǔn設(shè)計(jì)載體比例和 MS 參數(shù)。

二、分離技術(shù)：提升靈敏度與分辨率

1、液相色譜（LC）優(yōu)化

納升級(jí) LC 在 single cell 中廣泛應(yīng)用，但低流速易受堵塞影響；而 Evosep One Whisper-Flow 技術(shù)優(yōu)化了通量和穩(wěn)定性

2、毛細(xì)管電泳–質(zhì)譜（CE–MS）

CE–MS 檢測(cè)靈敏度可達(dá) 1 zmol，適合分離疏水肽及 PTM 修飾肽

（1） CE 與 LC 職能互補(bǔ)，可實(shí)現(xiàn)更廣泛的肽段覆蓋。

（2）尤其適合對(duì)翻譯后修飾（如磷酸化、糖基化）進(jìn)行高靈敏度分析。

3、離子遷移（Ion Mobility）分離

（1）4D?DIA 技術(shù)在 LC–MS/MS 基礎(chǔ)上加入離子遷移維度（ion mobility），提高多肽分辨率與 MS2 可信度

（2）DIA 方法比DDA 更全面、缺失值更少，是單細(xì)胞多肽采集的關(guān)鍵策略

三、質(zhì)譜檢測(cè)：靈敏度 vs. 通量

1、儀器發(fā)展的雙重趨勢(shì)

（1）Orbitrap Astral 與 timsTOF PASEF 等新型質(zhì)譜儀提升 ms1 MS2 捕獲率和準(zhǔn)確度；

（2）通過(guò)優(yōu)化儀器掃描模式，zuì終實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞中千蛋白水平定量

2、DDA vs. DIA：缺失模式與全譜模式

（1）DDA：選擇性碎片化易遺漏低豐度多肽，單細(xì)胞中因信號(hào)稀薄，隨機(jī)性更強(qiáng) 。

（2）DIA：掃描全質(zhì)量范圍，減少隨機(jī)性，適合高通量單細(xì)胞檢測(cè)，配合機(jī)器學(xué)習(xí)提升肽段解讀

四、數(shù)據(jù)分析：識(shí)別率、缺失值、定量誤差

1、肽段識(shí)別算法的適配

單細(xì)胞樣本縮小厚度導(dǎo)致碎片譜圖更復(fù)雜，常見數(shù)據(jù)庫(kù)查重和假陽(yáng)性率上升 。

（1）需激活更低的 FDR 閾值，并借助 open-search、深度學(xué)習(xí)譜圖識(shí)別算法，如 Spectronaut、DIA-NN。

2、缺失值與歸一化策略

由于低豐度多肽經(jīng)常檢測(cè)不到，造成空值頻發(fā)。

（1）引入載體細(xì)胞：提高 MS1 信號(hào)；

（2）使用多重 imputation 方法：如 KNN、Low rank、MLE，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)完整性。

（3）algorithmic normalization，如 LOESS、vsn 標(biāo)準(zhǔn)化，緩解批次效應(yīng)對(duì)定量的偏差。

3、統(tǒng)計(jì)顯著性與多組比較

單細(xì)胞研究通常涉及 103–10? 個(gè)細(xì)胞，組間差異統(tǒng)計(jì)需采用單細(xì)胞tèyǒu算法，如 MAST、SCDE，結(jié)合蛋白豐度變化探測(cè)。SCP 工具推薦實(shí)踐如 Gatto 等的社區(qū)建議

五、挑戰(zhàn)綜述與未來(lái)機(jī)遇

1、挑戰(zhàn)一：動(dòng)態(tài)范圍與低豐度蛋白

單細(xì)胞蛋白豐度跨度超過(guò) 10^5–10^7 級(jí)別，低豐度信號(hào)極易被噪音掩蓋 。未來(lái)可結(jié)合 top?down 或 middle?down 分析，增加 PTM 和蛋白同種型信息。

2、挑戰(zhàn)二：通量 vs. 靈敏度的權(quán)衡

高通量要求細(xì)胞處理自動(dòng)化；靈敏度需長(zhǎng) LC 流程。zuì優(yōu)策略是結(jié)合 Evosep 電動(dòng)樣本載入 + timsTOF 快速掃描 + DIA 方法，實(shí)現(xiàn)平衡。

3、挑戰(zhàn)三：標(biāo)準(zhǔn)化與可重復(fù)性

目前方法多樣，缺乏統(tǒng)一 SOP 和 QC 指標(biāo)，可結(jié)合 SCP 跟蹤 PTM 調(diào)控機(jī)制，并整合 AI 模型預(yù)測(cè)功能。

Bottom?Up 方法在單細(xì)胞dànbáizhì組學(xué)中既面對(duì)靈敏度、準(zhǔn)確度與樣本損失的挑戰(zhàn)，也擁有高通量、低成本與平臺(tái)兼容性的dútè機(jī)遇。隨著儀器性能、自動(dòng)化和 AI 數(shù)據(jù)處理的進(jìn)步，SCP 正處于類似單細(xì)胞 RNA-seq 早期時(shí)代的“爆發(fā)前夜" 。在這個(gè)變革期，百泰派克生物科技面對(duì)行業(yè)前沿，梯度排列技術(shù)儲(chǔ)備與定量策略，為科研機(jī)構(gòu)和生命科學(xué)企業(yè)提供 “從單細(xì)胞到臨床應(yīng)用" 的全流程 bottom?up SCP 解決方案。期待與各方合作，共同邁入單細(xì)胞dànbáizhì新紀(jì)元！

百泰派克生物科技特色項(xiàng)目

一、蛋白測(cè)序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀及島津公司埃德曼降解測(cè)序系統(tǒng)對(duì)dànbáizhì序列進(jìn)行分析，提供基于質(zhì)譜的蛋白測(cè)序分析服務(wù)，包括對(duì)dànbáizhì的氨基酸組成分析，Nduāncèxù，Cduāncèxù和全序列分析，以及基于埃德曼降解的dànbáizhìN端序列分析服務(wù)。對(duì)于未知理論序列的dànbáizhì，提供基于從頭測(cè)序法的dànbáizhì從頭測(cè)序服務(wù)，對(duì)蛋白序列進(jìn)行分析。

※服務(wù)優(yōu)勢(shì)：

1.采用目前世界上優(yōu)良的質(zhì)譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可實(shí)現(xiàn)對(duì)所測(cè)定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;

3.可測(cè)定蛋白N端多達(dá) 70個(gè)氨基酸序列;

4.可測(cè)定多種形式的樣品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白條帶;

5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug，即可完成檢測(cè);

6.測(cè)序不受N端封閉，PEC和和糖基化等N端修飾的影響。

二、dànbáizhì組學(xué)

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜平臺(tái)結(jié)合Nano-LC，提供定量dànbáizhì組學(xué)、靶向dànbáizhì組學(xué)、多肽組學(xué)、翻譯后修飾蛋白組學(xué)等多種dànbáizhì組學(xué)分析服務(wù)。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4Ddànbáizhì組學(xué)服務(wù)，助力微量樣本蛋白組學(xué)、大樣本群醫(yī)學(xué)及高通量修飾組學(xué)等研究工作。

※服務(wù)優(yōu)勢(shì)：

1 .高通量定量蛋白分析:多對(duì)照組大規(guī)模實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物;

2.體內(nèi)體外多種dànbáizhì標(biāo)記方法，適用于分析組織、細(xì)胞、血液等多種樣品;

3.質(zhì)譜分析靈敏度高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)度高;

4.可檢測(cè)較低豐度蛋白，線性范圍廣;

5.zhuānyè生物信息學(xué)分析，分析更系統(tǒng)準(zhǔn)確。

三、單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm質(zhì)譜流式系統(tǒng)進(jìn)行單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析，采用金屬元素標(biāo)記物（通常是金屬元素標(biāo)記的特異抗體）標(biāo)記細(xì)胞表面和內(nèi)部的分子，然后用流式細(xì)胞原理分離單個(gè)細(xì)胞，再用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）分析單個(gè)細(xì)胞的原子質(zhì)量譜，zuì后將原子質(zhì)量譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號(hào)分子表達(dá)量。

※服務(wù)優(yōu)勢(shì)：

1.技術(shù)優(yōu)良，*技術(shù)空白

采用金屬標(biāo)記抗體技術(shù)，避免了傳統(tǒng)流式熒光通道少且易相互影響的問題?？稍趩渭?xì)胞層面上對(duì)多種指標(biāo)同時(shí)進(jìn)行表征，百泰派克生物科技可做到同時(shí)檢測(cè)51個(gè)目標(biāo)蛋白。

2.分析數(shù)量大，成本較低

單細(xì)胞RNAseq受成本等因素限制，所有樣本細(xì)胞匯總的分析數(shù)目一般在2x10^4個(gè)左右，而流式質(zhì)譜技術(shù)一次（單樣本）就可分析至少10^5的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了數(shù)量級(jí)的提高，且成本不高于單細(xì)胞RNAseq。

3.應(yīng)用前景大

①流式質(zhì)譜結(jié)果可以給出細(xì)胞亞群的變化，在臨床診斷、疾病機(jī)制研究等方面具有極大的研究前景；

②將金屬標(biāo)簽技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合會(huì)有新應(yīng)用方向。除常規(guī)蛋白外，質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)還可用于蛋白翻譯后修飾；

③可檢測(cè)細(xì)胞存活率、細(xì)胞大小、mRNA轉(zhuǎn)錄子表達(dá)量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)

百泰派克生物科技的基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)一站式解決方案包括我們專有的、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案。我們能夠幫助您實(shí)現(xiàn)10,000個(gè)以上I型多肽和10,000個(gè)以上II型多肽的鑒定和識(shí)別。通過(guò)我們優(yōu)化的高通量免疫多肽組學(xué)分析平臺(tái)進(jìn)行免疫肽組學(xué)分析，可從zuì小的樣品材料中進(jìn)行可重復(fù)的識(shí)別和定量。該服務(wù)可以應(yīng)用于大規(guī)模的研究，旨在助力科研工作者尋找癌癥、免疫疾病及傳染病的解決方案，深入挖掘未知的靶標(biāo)。

五、生物藥物表征

百泰派克基于高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，MALDI TOF，高效色譜分離技術(shù)，提供一系列完善的生物藥物分析方案，從dànbáizhì、多肽、抗體、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級(jí)結(jié)構(gòu)分析，到產(chǎn)品變異性和純度分析。旨在提供優(yōu)質(zhì)生物藥物分析服務(wù)，幫助生物醫(yī)藥生產(chǎn)商提高生物藥物品質(zhì)。

百泰派克生物科技七大檢測(cè)平臺(tái)

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物質(zhì)譜多組學(xué)優(yōu)質(zhì)服務(wù)商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫(yī)療器械行業(yè)提供質(zhì)量控制檢測(cè)和項(xiàng)目驗(yàn)證等zhuānyè服務(wù)。公司實(shí)驗(yàn)室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規(guī)和指導(dǎo)原則，通過(guò)CNAS/ISO9001雙重質(zhì)量體系認(rèn)證，建立了完備的質(zhì)量體系，數(shù)據(jù)冷熱/異地備份，設(shè)備定期計(jì)量/期間核查，軟件審計(jì)追蹤，為客戶提供一體化解決方案和技術(shù)服務(wù)，支持新藥研發(fā)、藥物申報(bào)注冊(cè)和生產(chǎn)放行。

1.公司采用ISO9001質(zhì)量控制體系，zhuānyè提供以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的CRO檢測(cè)分析服務(wù)；

2.獲國(guó)家CNAS實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可，為客戶提供符合全球藥政法規(guī)的藥物質(zhì)量研究服務(wù)；

3.業(yè)務(wù)范圍覆蓋dànbáizhì組學(xué)、多肽組學(xué)、代謝組學(xué)、生物藥物表征、單細(xì)胞分析、單細(xì)胞質(zhì)譜流式、生信云分析以及多組學(xué)生物質(zhì)譜整合分析等；

4.七大質(zhì)量控制檢測(cè)平臺(tái)，滿足您一站式服務(wù)需求；

5.服務(wù)3000+企業(yè)，10000+客戶的選擇；

6.致力于為您提供優(yōu)質(zhì)的生物質(zhì)譜分析服務(wù)!

Bottom-Up 方法在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)中的挑戰(zhàn)與機(jī)遇檢測(cè)技術(shù)服務(wù)詳情介紹