氟喹諾酮類ELISA檢測試劑盒操作步驟

氟喹諾酮類快速檢測試劑盒

使用說明書

【原理】

       試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物氟喹諾酮類和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗氟喹諾酮類抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留氟喹諾酮類的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物氟喹諾酮類的含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】  

規(guī)       格：96孔/盒

靈 敏 度：0.5ppb

檢測時間： 45min

交叉反應(yīng)率：

環(huán)丙沙星（CIF）…………………………100％

恩諾沙星（ENR）…………………………75%

氧氟沙星（OFL）………………………… 99％

奧索利酸（OXO）………………………116％

達(dá)氟沙星（DAN）…………………………65％

諾氟沙星（NOR）……………………… 198％

洛美沙星（LOM）……………………… 86％

培氟沙星（PEF）…………………………56％

沙拉沙星（Sarafloxacin）……………190％

依諾沙星（ENO）…………………………98％

氟喹酸（FLU）…………………………… 96％

麻保沙星（MAR）……………………… 110％

氨氟沙星（AMI）…………………………98％

那氟沙星（NAD）…………………………56％

樣本回收率：

組   織…………………………………80±15%

血   清…………………………………80±15%

蜂   蜜 ……………………………… 75±15%

氟喹諾酮類檢測下限分別為：

環(huán)丙沙星（CIF） 檢測下限…………………………0.5ppb

恩諾沙星（ENR）檢測下限……………………約1ppb

氧氟沙星（OFL）檢測下限………………………約0.5ppb

達(dá)氟沙星（DAN）檢測下限………………………約1ppb

諾氟沙星（NOR）檢測下限……………………約0.25 ppb

洛美沙星（LOM）檢測下限………………………約0.5ppb

培氟沙星 （PEF）檢測下限……………………約0.25ppb

沙拉沙星檢測下限………………………………約0.55ppb

依諾沙星（ENO）檢測下限………………………約0.5ppb

奧索利酸（OXO）檢測下限………………………約0.5ppb

氟喹酸?。?/span>FLU）檢測下限………………………約.5ppb

麻保沙星（MAR）檢測下限………………………約0.5ppb

氨氟沙星（AMI）檢測下限………………………約0.5ppb

那氟沙星（NAD）檢測下限………………………約1ppb

【試劑盒組成】  

1、 微量測試孔：每條8孔，一板12條

2、 標(biāo)準(zhǔn)品溶液×6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.5ppb、1.5 ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb

3、 高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：×1瓶：（1ml/瓶） 1ppm

4、 抗體工作液         7 ml …………………………… 綠色帽

5、 酶標(biāo)記物             7 ml …………………………… 紅色帽

6、 底物A液             7ml………………………………棕色帽

7、 底物B液　         7ml………………………………黑色帽

8、 終止液                  7ml………………………………黃色帽

9、 20X濃縮洗滌液40 ml ……………………………白色帽

10、 2X濃縮復(fù)溶液    50 ml ……………………………藍(lán)色帽

【所用儀器、試劑】  

具備的儀器：微孔酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道20µl-200µl、100µl-1000µl，多道250µl

試         劑：濃鹽酸、二氯甲烷、正己烷、乙腈、肝素鈉

                    Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、

【實驗前溶液配制】

配液1、0.1M HCL溶液  

860µl濃鹽酸加去離子水100ml溶解。

配液2、乙腈-0.1MHCL溶液

V_乙腈：V_{0.1M –HCL} ＝ 84：16

配液3、乙腈-二氯甲烷混合溶液

V_乙腈-V_二氯甲烷  =  1 : 4

配液4、pH7.2 0.05M PB緩沖液

12.9gNa₂HPO₄·12H₂O+2.175gNaH₂PO₄·2H₂O

            加去離子水1L溶解。

配液5、pH7.2  0.02MPB緩沖液

5.16gNa₂HPO₄·12H₂O+0.87g NaH₂PO₄·2H₂O

加去離子水1L溶解。

配液6、用去離子水將2X濃縮復(fù)溶液按1：1稀釋

（1份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本復(fù)溶。

配液7：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19

              稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量

              配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】  

樣本前處理須知    處理任何樣本時，都必須注意：

（1）本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚、蝦、蛋類等。

（2）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同試劑時要更換吸頭。

（3）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

（a）組織/蛋類樣本（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚、蛋類等）

1、 稱2.0±0.05g 均質(zhì)樣本于50ml離心管中；

2、 加入乙腈-二氯甲烷混合溶液8ml，振蕩5min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、 取4ml清澈有機(jī)相至干燥溶器中，56℃氮?dú)獯蹈?/span>/旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；

4、 用1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上，15℃離心5min；

5、 去除上層取下層50µl液體用于分析。

        樣本稀釋倍數(shù)：1

（b） 組織/蛋類低檢測限處理方法二

1、稱取2.0±0.05g均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中；加入4ml 0.02M  PB緩沖液，充分振蕩2min，于15℃，4000r/min以上速度離心10min

2、取50µl液體與450µl稀釋后的復(fù)溶液

2、取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：20倍

（c）血清樣本的處理

1、 用加有肝素鈉（20-30單位/ml血）的離心管采集血樣本（建議采血注射器也用肝素鈉潤洗），血樣本室溫靜置1h，待析出血漿后4000r/min以上，15℃離心10min，取出血漿1ml；

2、 加入乙腈（無水）4ml上下充分混合5min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、 移上清至另一離心管中，加入2ml 0.02M PB緩沖液，混勻；

4、 加入二氯甲烷5ml，充分混勻5min，4000r/min，15℃離心10min，去上層，取下層有機(jī)相到干燥瓶中（清亮無雜質(zhì)），50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干/氮?dú)獯蹈桑?/span>

5、 用1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上，15℃離心5min；

6、 輕吸掉上層和中間白色雜質(zhì)，取下層相100µl加入100µl稀釋后的復(fù)溶液，混合30s；

7、 取50µl用于分析。

       樣本稀釋倍數(shù)：2

（d）蜂蜜高檢測限發(fā)法方法

1、 取1g蜂蜜，加６ml乙腈-0.1MHCL溶液振蕩至蜂蜜全部溶解；

2、 加入３ml 0.05M PB緩沖液，加入11ml二氯甲烷，振蕩5min，4000r/min以上離心5min；

3、 輕吸掉上層，取下層有機(jī)相８ml至干燥溶器中，56℃氮?dú)獯蹈桑?/span>

4、 用1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，再加入正己烷1ml混合30s，3000r/min以上，15℃離心5min；

5、 去除上層取下層50µl液體用于分析。

       稀釋倍數(shù)：2

（e）蜂蜜低檢測限發(fā)法方法

1、 稱取2±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中，加入4ml 0.02M  PB緩沖液充分振蕩2min，；

2、 取50µl與950µl已稀釋好的復(fù)溶液復(fù)溶，混合30s；

3、 取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：40倍

（f）牛奶

1、取出50μl 牛奶于另一試管中，加入1950μl樣本稀釋液混30s；

2、取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：40倍

【酶標(biāo)免疫分析程序】  

操作步驟：

1、 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷凍。

3、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均需做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔的樣本孔所在的位置。

4、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl /孔，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔,再加入50µl/孔抗體工作液。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。

5、 取出用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 顯色：每孔加入底物液A液50µl再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。

7、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值（OD值）。

【結(jié)果判定】  

     結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與氟喹諾酮類的含量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.238， 樣本2的吸光度值為0.946，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.845；0.5ppb為1.542；1.5ppb為1.130； 4.5ppb為0.635；13.5ppb為0.326； 40.5ppb為0.156。則樣本1的濃度范圍是13.5ppb-40.5ppb；樣本2的濃度范圍是1.5ppb-4.5ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氟喹諾酮類的實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以氟喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氟喹諾酮類的實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索?。?/span>

3、標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線：

B/B0 (%)

          0.5                1.5                  4.5                  13.5                40.5

(ppb) [µg/kg]

圖1：氟喹諾酮檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

%CV

        0       0.5      1.5      4.5     13.5     40.5

(ppb) [µg/kg]

圖2：氟喹諾酮檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出喹諾酮檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)喹諾酮濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項】  

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。